重组DNA技术

一、重组DNA技术的概述
(一） 重组DNA技术的相关概念

1. 自然界基因转移和重组重组DNA技术是在人们对自然界基因转移和重组的认基 础上创立的新技术。自然界基因转移伴发重组有几种形式:位点特异的重组、同源重组及转座 重组。依赖整合酶、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称位点特异的重组。发生在 同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。而转座重组即某些基因从一个位置移动到 另一位置。
2. 重组DNA技术细菌的基因转移包括接合作用、转化作用、转导作用等。当细胞与细 胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞转移至另一细胞，这种类型的DNA转 移称为接合作用。通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的 遗传表型，这就是转化作用。由病毒携带、将宿主DNA片段从一个细胞转移至另一细胞的现 象或机制，称为转导作用。在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连 接即为重组。

所谓克隆就是来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆 化，也就是无性繁殖。为研究基因的结构与功能，从构建的基因组DNA文库或cDNA文库分 离、扩增某一感兴趣的基因就是基因克隆或分子克隆，又称重组DNA技术。
(二） 基因工程基本原理
一个完整的基因克隆过程应包括：目的基因的获取、克隆基因载体的选择与改造、目的基 因与载体的连接、重组DNA分子导人受体细胞、筛选出含感兴趣基因的重组DNA转化细胞。
实现上述过程需要一些重要的工具酶，如限制性内切核酸酶及连接酶等。限制性内切核 酸酶是一类识别DNA特异序列的内切核酸酶。需利用序列特异的限制性核酸内切酶在准确 的位置切割DNA,使较大的DNA分子成为一定大小的DNA片段;构建重组DNA分子时，必 须在DNA连接酶催化下才能使DNA片段与克隆载体共价连接。此外，还有一些工具酶也都 是重组DNA时所必不可少的。

1. 目的基因的获取外源基因又称目的基因，其来源有几种途径:化学合成，酶促合成 cDNA,制备的基因组DNA及PCR技术。将外源基因连接到复制子上，构建嵌合DNA，外源 基因即可作为复制子的一部分在宿主细胞复制。细菌质粒、噬菌体和一些病毒DNA均可被 改造成基因克隆的载体。分离的克隆cDNA或基因与适当表达载体连接后可实现目的基因 在E. c_〇U或其他表达体系的表达。.
2. 基因载体的选择与构建可作为基因载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和 病毒DNA，它们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。
3. 外源基因与载体的连接将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的体外重 组。这种连接方式有:黏性末端连接、平端连接和人工接头连接等。
4. 重组DNA导人宿主细胞外源DNA(含目的DNA)与载体在体外连接成重组DNA 分子(嵌合DNA)后，需将其导人宿主细胞。随受体细胞生长、增殖，重组DNA分子得以复 制、扩增。