第十九节免疫学检测技术
2020-01-12 来源：未知 内容标签：第十九,节,免疫学,检测技术,第十九,节,
导读：第十九节免疫学检测技术 一、抗体的检测及应用抗体进行的检测 (― ) 概念 利用抗原和抗体特异性结合的性质，可采用抗原对抗体进行定性、定量检测，也可采用抗 体对抗原进行定性
第十九节免疫学检测技术
一、抗体的检测及应用抗体进行的检测
(―)概念
利用抗原和抗体特异性结合的性质，可采用抗原对抗体进行定性、定量检测，也可采用抗 体对抗原进行定性、定量检测。由于抗体常存在于血清中，习惯上将体外的抗原-抗体反应称 为血清学反应。
(二） 血凝抑制
血凝抑制试验是检测血清中血凝素中和抗体的试验。流感病毒包膜上的血凝素可凝集红 细胞，血凝素中和抗体可抑制这种凝集。在微量培养板的微孔中加人流感病毒、红细胞、待检 血清共同作用，若待检血清中存在血凝素特异性抗体，凝集被抑制。该实验可被用于定量检测 流感病毒感染者或流感病毒疫苗接种者血清中的流感病毒中和抗体。
(三） 凝集反应和血型的鉴定
颗粒性抗原(如细菌、红细胞、偶联到乳胶颗粒上的抗原)与相应抗体结合后出现肉眼可见 的凝集现象，该反应称为凝集反应。
颗粒性抗原与相应抗体结合产生的凝集反应被称为直接凝集。直接凝集实验可在载玻片 上操作，被用来鉴定细菌和血型。直接凝集实验也可在试管中操作，被用来检测抗体的滴度。
将可溶性抗原或抗体包被在红细胞或乳胶颗粒载体表面后，与相应抗体或抗原作用出现 的凝集被称为间接凝集。以红细胞为颗粒载体的间接凝集被称为间接血球凝集，以聚苯乙烯 乳胶颗粒为颗粒载体的间接凝集被称为间接乳胶颗粒凝集。吸附人IgG的乳胶颗粒可被用 于检测类风湿因子(抗IgG抗体)。将已知抗体吸附在载体上的凝集称为反向间接凝集，该法 可被用于红细胞Rh抗原的检测。
(四） 免疫荧光
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的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白（PE)等。FITC和PE在激发光作用下可分别 发绿色焚光和红色突光。免疫荧光法可被用于CD分子的鉴定、细胞蛋白的定位等。结果的 判定需用荧光显微镜、流式细胞仪或共聚焦显微镜。
(五） 放射免疫
放射免疫是用放射性核素标记抗原或抗体进行抗体或抗原定性、定量检测的方法。放射 免疫可被应用于激素等微量物质的检测。
(六） 酶免疫(ELISA和免疫组化）
1•酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 是将抗原或抗体 与固相载体(如聚苯乙烯板)结合，然后加人待测抗体或抗原，最后以酶标二抗和底物进行显色 的检测抗体或抗原的技术。ELISA可被用于抗原或血清抗体的定量检测。
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免疫组化(immunohistochemistry)是应用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗 原抗体反应和酶-底物的显色反应，对细胞中的抗原进行定位、定性检测的方法。
(七） 免疫电镜
免疫电镜是将免疫化学技术与电镜技术结合，在超微结构水平观察抗原抗体结合的方法。 带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合可形成具有一定电子密度的复合物，这种复合物可在 电子显微镜下观察到。采用免疫电镜可在亚细胞水平对蛋白进行定位。
(八） 免疫沉淀
免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)是用特异性抗体自细胞裂解物分离特异性蛋白抗原 的方法。基本步骤为:在细胞裂解液中加人特异性抗体，抗体和特异性蛋白结合;用葡萄球菌 蛋白-A(结合Ig Fc段)琼脂糖珠纯化分离免疫复合物。免疫复合物中的抗原是被特异性抗体 沉淀出来的蛋白。对沉淀出来的蛋白可用免疫印迹进行检测。被沉淀出的蛋白若属功能蛋 白，可对其进行功能测定，如激酶活性测定等。
(九） 免疫印迹
免疫印迹(immunoblotting)，又称Western blotting,是一种采用抗体检测蛋白质的分子 量和抗原特异性的方法。其步骤为:将可溶性蛋白或细胞裂解物等进行SD&聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SD&PAGE),使蛋白根据分子量的不同分散到聚丙烯酰胺凝胶的相应部位形成条带;通 过印迹法将蛋白条带转移至固相的硝酸纤维素膜(NC)或聚偏二氟乙烯(pyBio上;将转印膜 置于液相中和特异性的抗体共浴;洗去未结合的抗体;用酶标记二抗识别和蛋白结合的特异性 抗体;加酶底物显色。出现颜色的条带代表被特异性抗体识别的蛋白。根据蛋白质分子量标 尺可粗略判断出被识别的抗体的分子量。
二、免疫细胞的分离
(一）Ficoll-Hypaque 离心法
葡聚糖-泛影葡胺(又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法是分离人外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的常用方法。将抗凝血滴加于分离液上，离心后， 外周血中各种血细胞按比重分层:红细胞在管底;PBMC分布于血浆层与分离液界面;最上层 是血浆;血小板悬浮于血聚中。PBMC含淋巴细胞和单核细胞。从PBMC可进一步分离T细
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(二） 磁珠分离法
CD4抗体磁珠加至细胞悬液中结合CD4+细胞;用磁场将结合在磁珠上的细胞和未结合的细 胞分离即可获得纯化的CD4+细胞。
(三） 流式细胞术
流式细胞术(flow cytometry，FCM)是用焚光活化细胞分类仪（fluorescence*activated cell
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er，FACS)通过细胞表面CD分子的检测而对细胞进行分类和定量的方法。用突光素标记 的单克隆抗体与细胞表面CD分子特异性结合，而后将细胞液滴射流经流动室喷嘴以单个细 胞喷出，并经高速聚焦激光束照射，以激发荧光颜色和强度标识是否具有相应CD分子，从而 鉴定、分离不同类型细胞。
三、免疫细胞的特异性、数量和功能检测
{—)流式细胞术
根据表面表达CD分子的种类、水平和多种CD分子表达格局，以流式细胞术可以二维荧 光方图和比例统计显示待测细胞群体中表达特定CD分子细胞的比例、数量、表达水平的高 低。若同时结合细胞因子如IFN-7或细胞凋亡标志可测定的功能性CTL或凋亡细胞的比 例。采用不同颜色荧光标记物标记的抗体可同时检测一个细胞上的多种分子。
(二） T细胞增殖试验
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3H-TdR掺人法在体外培养的条件下，T淋巴细胞受特异性抗原或非特异性有丝分 裂原如刀豆蛋白A(ConA)刺激后可发生大量增生，转化为淋巴母细胞。在此过程中，T细胞 的DNA合成明显增加，加人気标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)会被掺人DNA分子中。抗原 刺激72小时后收集细胞，用液体闪烁仪测定样本中放射性活性，可以掺入放射性核素的量反 映细胞的增殖水平。器官移植前取受体与供体的淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养试验可用3 H-TdR掺入法进行。该法可被用于检测各种细胞的增殖。
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MTT比色法MTT是一种噻唑盐，淡黄色可溶性物质。细胞增殖时，线粒体中的琥 珀酸脱氢酶将MTT还原为紫褐色的甲臜颗粒，该颗粒被随后加人的异丙醇或二甲基亚砜所• 溶解。用酶标仪测定细胞培养上清液中溶解的紫褐色甲臜产生的0D值，即可反映细胞的增 殖水平。
(三） 细胞毒试验
用细胞毒试验可检测CTL和NK细胞的靶细胞杀伤活性,具体的做法是:将效应细胞 (CTL或NK)和用
51 Cr标记的靶细胞相互作用4小时，被杀伤的靶细胞可释放
51 Cr。测定培 养上清中
51 Cr放射性可判定细胞毒的强弱，放射性越高代表细胞毒活性越强。
(四） 细胞凋亡检测
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琼脂糖凝胶电泳法凋亡细胞的DNA被核酸内切酶在核小体之间切割，产生长度为 180〜200bp及其倍数的DNA片段，这些片段在琼脂糖凝胶电泳后在凝胶上呈现梯状的DNA 区带谱。该区带谱显示细胞的凋亡。
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FACS法正常细胞的DNA为二倍体，当细胞发生凋亡时，DNA断裂成非二倍体或 亚二倍体，故在FACS的二倍体峰前出现一个亚二倍体峰。根据峰值大小可判断细胞凋亡的 百分率。另外以Annexin V荧光抗体染色可标识早期（30分钟）凋亡，而以PI荧光抗体染色
可标识晚期（90分钟以后）凋亡。
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连接至断裂的DNA 3'末端。根据标记到DNA断裂处的生物素的含量，可以判定细胞的凋亡 程度。可利用亲和素-生物素-酶放大系统检测发生标记的生物素的含量。
(五） 芯片技术
检测生物大分子的芯片主要包括DNA芯片（DNA microarray)和蛋白质芯片（protein microarray或protein chip)。蛋白质芯片是指固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵 列。可将抗原或抗体锚定在支持介质上制成蛋白芯片来大规模检测抗体或抗原。检定结果可 用荧光、酶显色或化学发光显示。
1•分析蛋白芯片（Analytical microarrays)也称捕获芯片（capture arrays)，是将抗体库 的抗体锚定在支持介质上而制成的芯片。该类芯片可被用于确定疾病状态细胞的蛋白表达谱 及表达水平，筛查血样中的抗原，发现疾病新的生物标志物(new disease biomarkers)，以及环 境监测和食品监察。
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功能蛋白芯片将很多种纯化的全长蛋白或其功能区“锚定”在支持介质上可制成功 能蛋白芯片(functional protein microarrays)。该类芯片可被用于:研究蛋白和其他分子间的 相互作用，如蛋白质和蛋白质，蛋白质和DNA，蛋白质和RNA，蛋白质和磷脂，蛋白质和小分 子;筛选特异性的抗体;确定酶如激酶的底物;确定受体的配体;鉴定抗体的特异性和交叉反应 性;筛选小分子药物。
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反向蛋白芯片将细胞裂解物“锚定”在支持介质上可制成反向蛋白芯片（reverse phase protein microarray，RPA)，然后用特异性抗体检测耙蛋白。该类芯片可被用于检测细 胞中存在的变化或修饰的蛋白质，借此判定其和疾病发生的关系。
(六） 细胞因子的生物活性检测
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细胞增殖法可用细胞增殖法检测细胞因子的促细胞生长活性。如采用IL-2依赖的 细胞株细胞做细胞增殖试验可检测IL-2的活性。
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细胞病变抑制法可采用细胞病变抑制法检测干扰素的抗病毒活性。将病毒易感细 胞和干扰素或含干扰素的样品共同培养24小时，然后再加入病毒继续培养。增殖的病毒会使 细胞发生病变。干扰素可抑制这种病变。通过抑制的程度可判定干扰素的活性高低。
